ANSES
Proposition de sujet Master 2 :

Intitulé du sujet :
Etude de la variabilité antigénique de la protéine E2 des pestivirus afin de caractériser la réponse immunitaire chez les ruminants

L'Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (Anses) : L'Anses est un établissement public à caractère administratif placé sous la tutelle des ministres chargés de la santé, de l'agriculture, de l'environnement, du travail et de la consommation. L'Anses met en oeuvre une expertise scientifique indépendante et pluraliste. Elle contribue principalement à assurer la sécurité sanitaire humaine dans les domaines de l'environnement, du travail et de l'alimentation. Elle contribue également à assurer la protection de la santé et du bien-être des animaux, à la protection de la santé des végétaux et à l'évaluation des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles des aliments. Elle exerce enfin des missions relatives aux médicaments vétérinaires.

Conditions de stages :
Lieu du stage : Laboratoire de l'Anses Sophia Antipolis, Unité Pathologie des Ruminants.
Adresse : 105 route des Chappes, les Templiers,
BP111 F-06902 SOPHIA ANTIPOLIS cedex
Web: www.anses.fr
Durée du stage : 6 mois à partir de janvier ou février 2011.
Rémunération : Une allocation mensuelle de stage de 417,08 euros est accordée par la direction scientifique de l'Anses (dossier à compléter avec le responsable chargé du suivi du stage).

Responsable scientifique chargé du suivi du stage :
Encadrant : Dr. Véronique DUQUESNE
E-mail : veronique.duquesne@anses.fr

Co-Encadrant : Dr. Eric DUBOIS
E-mail : eric.dubois@anses.fr

Profil et compétences requises :
De formation BAC+5, vous possédez des connaissances dans les domaines suivants : biologie moléculaire (PCR, clonage...), virologie, culture cellulaire, immunologie, bio-informatique (analyse de séquences...). Vous avez un bon niveau en anglais.

Votre intérêt pour le travail en équipe ainsi que votre implication dans le bon fonctionnement du laboratoire seront appréciés.

Adresser votre candidature (lettre de motivation + cv) par mail à Véronique DUQUESNE et Eric DUBOIS.


Sujet (objectif, démarche et technique, collaboration(s)...) :
A l'intérieur de la famille des Flaviviridae, le genre Pestivirus comprend trois grandes espèces : Border Disease virus (BDV), Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) et Swine Fever Virus (SFV). Chez les ruminants, sauvages ou domestiques, ces virus sont responsables de pertes économiques non négligeables dans la plupart des pays, s'accompagnant de problèmes de reproduction et de santé. Historiquement, la nomenclature au sein des pestivirus s'est basée sur l'origine de l'hôte. Les BVDV et BDV n'ont cependant pas une spécificité d'espèces et de ce fait, peuvent infecter les bovins, les ovins, les caprins et les ruminants de la faune sauvage (chamois, mouflon...).

Le suivi du statut sérologique de cheptels ou de populations d'animaux sauvages est utilisé afin de d'apprécier l'incidence des infections à pestivirus. L'utilisation en ELISA d'une protéine non structurale commune au BVDV et BDV (p80/125 ou NS2/3) permet la détection des anticorps dirigés contre les pestivirus à la fois chez les bovins et les ovins. La détection des anticorps de type neutralisant constitue cependant la technique de référence. Ces anticorps sont majoritairement dirigés contre la glycoprotéine de surface E2. L'analyse des séquences protéiques montre un fort degré de variabilité (pouvant aller jusqu'à moins de 60% entre certains génotypes). Plusieurs travaux ont montré qu'il pouvait exister également une variabilité immunogénétique lors de tests croisés de séroneutralisation.

Récemment, lors d'études menées en Espagne, il a été observé qu'il était possible de définir la souche responsable de la séroconversion par un test de neutralisation virale utilisant six souches différentes de pestivirus (Marco et al., 2008 Dec 10, Research in Vet.Science). Dans cette étude, le sérum d'un mouflon montre une réactivité exclusive vis à vis d'une des 4 souches de BDV, suggérant une transmission par les ovins. Alors que les deux chèvres positives réagissent différemment mais toujours vis à vis de BDV. Pour les ovins et bovins testés, les souches donnant un titre élevé sont respectivement BDV et BVDV-1. Ces différentes observations suggèreraient donc qu'il existerait des épitopes spécifiques au sein de la protéine E2 qui permettraient d'identifier la souche responsable de l'infection.

Le projet propose d'étudier la variabilité génétique et antigénique de la protéine E2 et de développer les premiers outils nécessaires à la mise en place d'un test ELISA de caractérisation de la réponse sérologique.

Dans une première partie du stage, se basant sur les données récentes obtenues en Espagne (équipe du Dr. I. Marco), l'analyse moléculaire et protéique des séquences du gène E2 est envisagée sur un panel de souches disponibles. Le gène E2 est localisé dans la partie 5' du génome et code pour une glycoprotéine de 53 kDa (372 acides aminés). A partir de ces séquences nucléotidiques, les séquences protéiques en seront déduites afin d'analyser la variabilité. La comparaison de ces régions en fonction des clusters moléculaires ou protéiques permettra d'identifier des séquences protéiques potentiellement impliquées dans l'induction d'une réponse immunitaire spécifique de souche virale.

Dans un second temps, un anticorps polyclonal sera produit afin de sélectionner les futures constructions permettant l'expression des différents épitopes dans le système baculovirus. Ces polypeptides produits (ou des peptides synthétisés) seront utilisés dans un système ELISA qui permettra de définir sérologiquement les souches circulantes comme cela a été observé avec un test de séroneutralisation, plus délicat à mettre en oeuvre.

Mme Véronique DUQUESNE
veronique.duquesne@anses.fr